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舌・食道上皮幹細胞由来正常・異常オルガノイドの単一細胞4D動態・遺伝子発現解析

研究代表者 
上野 博夫
関西医科大学・医学部・実験病理学講座
http://www3.kmu.ac.jp/pathol1/

これまでの研究概要と新学術での研究計画

本研究においてはオルガノイド培養系を利用し、正常オルガノイド、がん化オルガノイド、障害後再生時オルガノイドを比較、 (超)多色細胞系譜追跡法による3次元動画解析にて幹細胞として挙動する細胞の特定、また観察したオルガノイド の単一細胞RNAseqにて幹細胞populationの同定、それぞれのpopulationに共通および特異的な幹細胞マーカーの同定、pathway 解析により幹細胞シグナルの変化を解析する。これらの研究の結果、オルガノイドという細胞社会における正常および異常状態における成体幹細胞の動態変化とそれによる病態の解明、特異的発現遺伝子同定、がん特異的幹細胞シグナル変化等が詳細に解析され、今後の分子標的療法開発、再生医療法開発に向けての基礎的理解が深まる事が期待できる。
研究手法:(1)舌、味蕾、食道由来オルガノイドの4NQOがん化時、放射線照射後再生時におけるオルガノイド樹立。 舌オルガノイドについては発がん物質4NQOを用いた舌がん由来上皮細胞より正常オルガノイドと大きく形態変化したがん化オルガノイドを既に確立している。また4NQOを用いて食道がんを起こすことにも成功している。放射線10Gy照射後骨髄レスキューしたマウスの再生時に舌、味蕾、食道サンプルを採取してオルガノイド培養を行い、これらの正常、異常オルガノイド培養系を確立する。 (2) (超)多色細胞系譜追跡法による正常オルガノイドおよび異常オルガノイドの2次元動画、ないし3次元動画解析法の樹立。幹細胞マーカーCreERT2マウスとRosa26-rainbowマウスを掛け合わせ、これらの成体マウスより舌、味蕾、食道サンプルを採取してオルガノイド培養を行う。オルガノイドが100細胞程度に達したらタモキシフェンを培地に加えて3次元動画解析を行い、幹細胞として挙動する細胞を特定する。 (3) オルガノイドの単一細胞RNAseqによる幹細胞特異的マーカー幹細胞特異的シグナルの同定 上記3次元動画イメージング後のオルガノイドをマトリゲル培地から単離して、コラゲナーゼを用いて単一細胞レベルに細胞を ばらばらにし、シングル・セルRNAseqを行う。各細胞の発現する蛍光色、それぞれの細胞の発現するmRNA情報を網羅的に解析、 Stem Cell ID法等の解析により細胞のクラスタリングを行い、上記のイメージング情報とリンク付けし成体幹細胞populationを特定する。またそのpopulationが発現する特異的遺伝子マーカーをリストアップする。また幹細胞シグナル解析に関しては同じ サンプルデータを解析ソフトウェアPathwayにて解析する。

 

参考文献

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  4. Tanaka T, Atsumi N, Nakamura N, Yanai H, Komai Y, Omachi T, Tanaka K, Ishigaki K, Saiga K, Ohsugi H, Tokuyama Y, Imahashi Y, Hisha H, Yoshida N, Kumano K, Okazaki K, and Ueno H. Bmi1-positive cells in the lingual epithelium could serve as cancer stem cells in tongue cancer. Sci.Rep. Article number:39386;doi:10.1038/srep39386 (2016)
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