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ゲノム編集細胞の蛍光+DNAバーコード二重標識技術開発による組織構築原理の解明

研究代表者 
川又理樹
九州大学 生体防御医学研究所 器官発生再生学分野
http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/labo/orgreg/top.html

研究概要

多色の蛍光で細胞を標識化することで個々の細胞の運命を追跡するlineage tracing法は、組組織幹細胞の同定や分化機序、周囲の細胞との相互間作用による組織・臓器の構築や疾患原理の解明に極めて重要な技術である。しかし、最も広く使用されているBrainbowシステムは3 or 4色での蛍光標識であり、同一組織構造が一様に広がる肝臓のような臓器では、例えば青色蛍光クラスター同士が隣接して存在した場合、これらが他クローンか、同一クローンかを判断することが難しい。極端なケースとしては体を循環する血液細胞の場合は、4色のみで全ての細胞を識別することは不可能である。そこで本研究では蛍光標識(マクロ)に加えてDNAバーコード(ミクロ)を同時に標識する新しい二重標識Brainbowシステムを開発し、同一蛍光細胞におけるクローナリティーを1細胞レベルまで分解・解析を可能にさせ、誤解釈のない実験系のもとで新しい組織・臓器構築の原理の解明を行う。更に、細胞の二重標識と同時にノックアウトなどのゲノム編集もできる工夫を施すことで、編集細胞の表現型をリアルタイムに追跡・解析を可能とする。これによりin vitro, in vivoの環境下で編集細胞がどのような振る舞いをするかを調べ、遺伝子機能が細胞ダイバースに与える影響を解析する。本研究では特に4倍体以上の倍数性を有する肝細胞が混じり合う肝臓に着目し、肝再生やがんにおける新たなメカニズムの解明を試みる。
 本研究遂行のためにはgRNA-Cas9のゲノム切断活性を調節する必要がある。我々はこれまでの研究で父・母、両アレルのindel誘導効率を蛍光により1細胞レベルでリアルタイム測定可能なシステムを開発し、これをもとにgRNA-Cas9活性を100%から0%まで自在に調節する技術を確立した(図)。この活性調節型CRISPR-Cas9技術を駆使して、1細胞レベルでゲノム編集+多色蛍光標識+DNAバーコード標識が同時に誘導可能な技術を開発し、上記の研究計画の遂行を目指す。

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参考文献

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